Identification of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis by the polymerase chain reaction [PCR]

The PCR offers the possibility of specific and very sensitive detection and/or identification of Cl. m. subsp. michiganensis in seeds. The described PCR method for identification of this pathogen is very fast (one day) and economical, because of the very small volume (10 μI) of the PCR reaction mixture. The method based on amplification of the bacterial plasmid DNA fragment may be very useful in routine identification of Cl. m. subsp. michiganensis from all other bacteria isolated from tomato seeds and may be an alternative tool in diagnostics, especially for the quarantine services.

Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis jest bardzo groźnym patogenem kwarantannowym pomidora, wywołującym chorobę zwaną bakteryjnym rakiem pomidora. Bakteria ta łatwo przenosi się z zakażonymi nasionami i sadzonkami. Pomimo opracowania różnych technik diagnostycznych do jej wykrywania, nadal stanowi duży problem w diagnozowaniu chorób pomidora. Powszechnie stosowane w Polsce wykrywanie tej bakterii, bazujące na testach enzymoimmunologicznych (ELISA), immunofluorescencyjnych, hodowli na pożywkach półselektywnych i testach biologicznych, jest często zawodne ze względu na duże serologiczne zróżnicowanie poszczególnych szczepów tej bakterii, obecność wielu bakterii saprofitycznych, tworzących kolonie nie różniące się morfologicznie od kolonii właściwych dla Cl. m. subsp. michiganensis, czy też mało przydatne ze względu na długi czas trwania testu i obecność infekcji latentnych. Jedną z nowoczesnych metod wykrywania i identyfikacji bakterii jest amplifikacja fragmentów DNA charakterystycznych dla jej genomu przy pomocy reakcji PCR. Metoda ta dopiero zaczyna być powszechnie stosowana w diagnostyce bakterii (nieliczne doniesienia, w większości z ostatnich trzech lat). Opracowana metoda identyfikacji Cl. m. subsp. michiganensis spośród różnych bakterii saprofitycznych obecnych na nasionach pomidora, charakteryzuje się bardzo dużą czułością (do wykrycia Cl. m. subsp. michiganensis wystarczy 200-300 bakterii / 1 ml), specyficznością (produkty amplifikacji DNA bakteryjnego o oczekiwanej długości 614 bp, uzyskiwano tylko w próbkach, w których znajdował się DNA z Cl. m. subsp. michiganensis) oraz szybkością (jeden dzień, wraz z izolacją DNA bakteryjnego). Ponadto opracowana metoda charakteryzuje się bardzo niskimi kosztami, gdyż cala reakcja amplifikacji DNA zachodzi w objętości 10 μI (4 μI zawiesiny DNA i 6 μI mieszaniny reakcyjnej), co sprawia, że stosowanie tej metody w powszechnej diagnostyce chorób bakteryjnych będzie coraz częstsze i będzie ona coraz bardziej konkurencyjna w stosunku do innych, obecnie stosowanych.